铁是几乎所有微生物所必需的一种重要微量元素，在生物体内有着许多重要的作用，作为许多酶类的辅基参与呼吸、基因调节、DNA前体合成及抗氧化应激等[1]。铁在自然界中主要以不溶性化合物的形式存在，在酸性缺氧的条件下，如人胃肠道内以二价游离铁的形式存在，而在哺乳动物体内大多数以血红素的形式存在于血红蛋白、肌红蛋白等血红素结合蛋白中，其他少数以与蛋白结合的形式存在，如转铁蛋白、乳铁蛋白[2]。因此，细菌通常编码可以从血红素、转铁蛋白、乳铁蛋白等获取铁源的转运系统。然而，细菌体内过多的铁会通过芬顿反应(Fe2++H2O2→Fe3++OH·)产生的活性氧损害生物大分子，如DNA、蛋白质等[3]。因此，细菌体内的铁离子含量会通过调控因子来严格控制。另外，细菌也会通过编码铁离子结合蛋白如DNA-binding protein from starved cells (Dps)，或通过铁外排泵的方式来减轻游离铁离子引起的芬顿反应[4]。
鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)是最新被归类于威克斯菌科(Weeksellaceae)里氏杆菌属(Riemerella)的革兰氏阴性杆菌[5]，主要感染鸭、鹅、火鸡等禽类，对哺乳动物不易感。目前，鉴定的鸭疫里默氏杆菌至少包含21个血清型，而且血清型之间无交叉保护作用[6]。另外，该菌的临床分离株具有多重耐药的特点[7]，因此很难通过现有疫苗或药物的方式在短时间内达到根除效果，目前仍然是威胁我国养鸭业健康发展的主要细菌性病原。细菌铁离子代谢系统已经被用于新型抗生素药物设计的靶点来研究[8-10]，而且与细菌的毒力、耐药等息息相关[11]。
鸭疫里默氏杆菌编码铁离子转运系统、血红素转运系统、铁离子利用调节系统和铁离子螯合系统等，这些系统相互协调在铁离子稳态中发挥着重要作用[12]。本文将对参与该菌铁离子稳态的TonB系统、TonB依赖性受体、铁代谢调节因子Fur及铁离子结合蛋白Dps的功能和作用机制进行了系统阐述，以期为更深入地研究该菌的铁离子代谢机制提供参考。
1 鸭疫里默氏杆菌TonB系统
1.1 革兰氏阴性菌TonB系统
在革兰氏阴性菌中，对大肠杆菌(Escherichia coli) TonB系统的研究较为详细。以大肠杆菌为例，其TonB系统由TonB、ExbB和ExbD 3个质膜蛋白质组成[13]。TonB系统位于质膜，其中TonB蛋白的N端在质膜与ExbB、ExbD蛋白相联系，C端跨膜与TonB依赖性受体相互作用；ExbB与ExbD由相同的操纵子编码，其利用质子动力向TonB蛋白赋能，从而将能量传递给TonB依赖性受体而参与物质的转运[14-15]。TonB系统在革兰氏阴性菌中的数量不等，如大肠杆菌中有一套TonB系统，鸭疫里默氏杆菌中有3套TonB系统[16-17]。TonB系统都具有1个或多个TonB依赖性受体与之对应，这些受体分别转运特定的一个或多个底物[18-19]。例如，大肠杆菌中的1个TonB系统与8个TonB依赖性受体相互作用，分别转运不同的营养物质[20]。
1.2 鸭疫里默氏杆菌TonB系统
基因组测序及分析表明，鸭疫里默氏杆菌编码3套独立的TonB系统，分别为ExbB1- ExbD1-TonB1、ExbB2-ExbD21-ExbD22-TonB2和单独存在的TonB3 (TonB family protein, TbfA)[12]。蛋白同源性分析表明TonB1与TonB2的一致性约为10.00%，TonB1与TonB3一致性约为10.65%，TonB2与TonB3的一致性约为34.71%[17]，提示它们各自的功能可能具有特异性。其他革兰氏阴性菌TonB序列中“YP”基序与TonB依赖性受体的TonB-box (与TonB蛋白相互作用的区域)有密切联系，“SSG”基序则是被认为与外膜受体识别有关，2种基序均高度保守[21]，但Liao等在分析了鸭疫里默氏杆菌ATCC 11845中3个TonB蛋白，均没有保守的“YP”和“SSG”基序[17]，提示鸭疫里默氏杆菌TonB系统与其他部分革兰氏阴性菌TonB系统存在不同的作用位点。
为了探讨鸭疫里默氏杆菌中3套TonB系统的功能，Liao等分别构建了tonB1、tonB2及tonB1tonB2基因的缺失株，检测了单缺和双缺后对血红素和铁离子利用的影响，结果表明，在血红素作为必需生长因子的条件下，与亲本株相比，tonBl缺失株生长缓慢，tonB2缺失株生长更慢，tonB1、tonB2双缺株生长受损更严重，说明TonB1和TonB2均参与了血红素的利用过程且TonB2更重要；在血清作为唯一铁源的培养基中，亲本株和tonB1缺失株生长良好，而tonB2缺失株和tonB1tonB2双缺失株则不能生长，说明TonB2还参与了铁离子的转运[17]。此结果在随后的研究中被进一步证明，Zhang等为判断缺失tonB2是否影响鸭疫里默氏杆菌对铁离子的利用，检测了亲本株和tonB2缺失株对链黑霉素的敏感性(链黑霉素是一种依赖胞内铁离子发挥作用的抗生素，胞内铁离子浓度越高对链黑霉素越敏感)，结果表明，与亲本株相比，tonB2缺失株对链黑霉素的敏感性降低，表明tonB2缺失株中的铁离子浓度低于亲本株，缺失tonB2影响了鸭疫里默氏杆菌对铁的转运效率[22]。Miao等同样构建了鸭疫里默氏杆菌CH-3株的tonB1、tonB2的缺失株，在铁限制性培养基中，tonB1缺失株与tonB2缺失株生长慢于亲本株且tonB2缺失株慢于tonB1缺失株[23]。此结果同样说明，TonB1及TonB2参与了铁离子的转运且TonB2转运效率更高。随后，Liu等构建了TonB3 (TbfA)的低表达株和过表达株，血红素利用实验表明TonB3并未参与血红素的利用[24]。
在大肠杆菌中，TonB系统的表达受铁离子调控，当铁离子浓度较低时，tonB基因的表达上调[25]。然而，在鸭疫里默氏杆菌中3个tonB基因均不受铁离子的调控，且在tonB1缺失株中，tonB2和tonB3的表达并未改变，同理，在tonB2缺失株中，tonB1和tonB3的表达也未改变[22]。此结果说明，3个TonB系统之间并不存在相互代偿的作用。
2 鸭疫里默氏杆菌TonB依赖性受体
TonB依赖性受体位于革兰氏阴性菌外膜，参与细菌摄取利用各种营养物质[26]。TonB依赖性受体在结构上高度相似，它们都由22条β桶状结构和位于N端的球状塞子结构域构成[27]。其N端塞子结构域具有一段保守的TonB-box序列与TonB蛋白发生相互作用，但不同外膜受体中的这些TonB-box序列不尽相同；在TonB受体不发挥功能时，TonB-box位于塞子结构域上，当TonB受体结合了底物之后，TonB-box就会与TonB蛋白的C端结构域相互作用并引起塞子结构域改变，从而使底物运输至周质[28]。
鸭疫里默氏杆菌至少编码31个TonB依赖性受体，而这些大多数受体的功能尚不明确。第一个被鉴定的鸭疫里默氏杆菌TonB依赖性受体为TonB-dependent receptor 1 (TbdR1)，Lu等通过在血红素作为唯一铁源培养基中的生长曲线证明了TbdR1参与了血红素的利用[29]，然而其具体机制未被揭示。随后，Liu等研究了RA CH-1株TonB依赖性受体B739_1208和B739_1343在铁利用过程中的作用，结果表明，在铁限制性培养基中，与亲本株相比，缺失株出现明显的生长障碍，说明TonB依赖性受体B739_1208和B739_1343参与了铁离子转运[30-31]，其具体机制也未被揭示。由于大多数鸭疫里默氏杆菌TonB依赖性的受体与已知功能的TonB依赖性的受体同源性很低，无法通过序列比对的方式来推测其功能。因此，Liu等测定并比对了富铁和限铁条件下鸭疫里默氏杆菌CH-1株的转录组，结果发现，多个编码TonB依赖性受体的基因在铁离子限制性培养基表达上调，其中包括1个TonB依赖性的受体基因B739_1416和1个假定脂蛋白基因B739_1417[32]。B739_1416和B739_1417位于同一操纵子，为了鉴定B739_1416和B739_1417是否参与铁或血红素转运，Liu等分别构建了B739_1416和B739_1417缺失株，并检测了缺失株对血红素利用的影响；结果表明，B739_1416和B739_1417均参与了血红素的转运过程；进一步研究表明，B739_1417编码1种外膜的血红素结合蛋白，其结合血红素的关键氨基酸位点为Y144、Y177和H149；B739_1416编码1个TonB依赖性的血红素受体且依赖TonB2复合物而发挥作用；B739_1417需要借助B739_1416而发挥转运血红素的功能，鉴于B739_1416和B739_1417在血红素转运中的功能，分别将其命名为RhuR (R. anatipestifer hemin uptake receptor)和RhuA (R. anatipestifer hemin uptake protein A)[33]。
3 鸭疫里默氏杆菌铁摄取调节子(Fur)参与了铁转运的调节
Fur是细菌铁代谢过程中最为重要的调节因子，其以Fe2+为辅助因子，通过与Fe2+结合形成Fur-Fe2+二聚体来调节铁代谢。当胞内铁离子浓度升高时，Fur-Fe2+二聚体与铁转运相关基因的启动子区域结合，抑制其表达，从而减少铁离子的摄入；当胞内铁离子浓度降低时，Fur主要以单体的形式存在，并从铁转运相关基因的启动子区域解离，促进其表达，从而增加铁离子的摄入[34]。Fur广泛存在于各种细菌，蛋白大小多数为15−17 kDa且序列具有高度同源性和相似性，由N端的DNA结合结构域及C端的二聚化结构域组成[35]。
鸭疫里默氏杆菌Fur蛋白与大肠杆菌Fur蛋白序列具有25%的一致性，鸭疫里默氏杆菌Fur缺失后导致其对链黑霉素的敏感性增加，说明胞内的铁离子浓度升高；同样是因为铁离子浓度升高所致，Fur缺失后导致对H2O2刺激的氧化应激反应的敏感性增加，并且胞内的ROS含量增加[36]。转录组测序与分析表明，Fur缺失后导致大量铁转运相关的基因表达上调[37]。进一步研究表明，Fur可以结合其调节基因的启动子区域序列(5′-GATAATGATAATCATTATC-3′)，此序列被称为鸭疫里默氏杆菌的Fur box序列[36-37]。
4 鸭疫里默氏杆菌Dps参与了铁解毒
当细菌胞内铁离子浓度升高时，除抑制铁转运相关基因的表达外，细菌还可以诱导表达铁结合蛋白，如Dps来螯合过多的铁离子，从而减少芬顿反应的发生[38]。在大肠杆菌中，Dps形成一个铁蛋白相似(ferritin-like)的球状多聚体结构，具有结合铁离子和DNA的双重功能[39]。大肠杆菌Dps在抵抗氧化应激、酸应激、饥饿应激等多种应激反应中发挥重要的作用[40]。
Tian等构建了鸭疫里默氏杆菌CH-1 dps基因缺失株及回补株，并鉴定了在抵抗铁毒性中的作用；结果表明，与亲本株相比，dps缺失株在稳定期对H2O2的敏感性增强，而在对数生长期，与亲本株相比，对H2O2的敏感性未改变，说明Dps主要在稳定期发挥作用；同样，鸭疫里默氏杆菌dps的表达在稳定期升高，而且受H2O2刺激的氧化应激反应调控[41]。为进一步揭示鸭疫里默氏杆菌Dps抗氧化应激反应的机制，Tian等实验表明，重组的鸭疫里默氏杆菌Dps在体外具有结合DNA的能力，而且能够保护H2O2对DNA引起的损伤[41]。
5 鸭疫里默氏杆菌铁代谢相关基因参与致病
从宿主中获取铁源是细菌致病的一个重要条件。在感染期间宿主会进一步限制体内游离铁离子的浓度，这种机制被称为“营养免疫”[42]。因此，细菌铁转运系统受损理论上就会导致对宿主的感染力降低。
在鸭疫里默氏杆菌中，TonB系统、TonB依赖性的受体(B739_1208、B739_1314、TbdR1)、Fur和Dps等缺失后，均降低了该菌对雏鸭的致病力或定殖力[29-31, 36, 41]，其中，减毒较明显的B739_1343和Fur缺失株的减毒效率均达到了104以上，B739_1343缺失株作为减毒疫苗免疫雏鸭，对亲本株的保护效率达83%以上[30]。
6 展望
虽然目前对部分革兰氏阴性菌的铁代谢机制相对清楚，但鸭疫里默氏杆菌铁代谢相关的机制仍不完全清楚。例如，鸭疫里默氏杆菌是否编码铁外排基因，鸭疫里默氏杆菌3个TonB系统与31个TonB依赖性的受体对应关系是什么，鸭疫里默氏杆菌的铁离子代谢是否与其多重耐药具有相关性，以及鸭疫里默氏杆菌的铁离子代谢与氧化应激又有怎样的联系等问题需要进一步解决。以上问题的解决有助于我们了解该菌从宿主中获取铁等营养物质的作用及调控机制，从一个新的角度设计新型抗菌药物或减毒疫苗，为鸭疫里默氏杆菌的有效防控提供借鉴。